Sterilizace kultivační nádoby bioreaktoru

Správně provedená sterilizace kultivační nádoby bioreaktou je základním předpokladem pro dobrý výsledek fermentace. Špatný postup nemusí hned vést ke zničení zařízení a ohrožení lidských životů, ale i kontaminace média před samotným očkováním dokáže zkazit den.

Vše samozřejmě začítá výběrem autoklávu. Hodí se každý sterilizátor na kultivační nádoby? Jak skutečně velká musí být vnitřní komora, aby se tam bioreaktor vešel? Na co je dobré si dát pozor a co se hodně v českých a slovenských laboratořích přehlíží?

Řádně stanovený (a dodržený) postup sterilizace eliminuje nejen chyby už ve fázi přípravy fermentoru, ale zajistí vám také reprodukovatelné podmínky dalších fermentací, a to i po zakoupení nového autoklávu.

Zajímá vás stolní bioreaktor, který se čistí a sterilizuje automaticky bez nutnosti připojení páry? Prohlédněte si video jedinečného systému LabCIP!

Základy

Výběr správného autoklávu

Pokud teprve vybíráte autokláv k vašemu bioreaktoru nebo jste ve fázi rozhodování o obou přístrojích, je vhodné tuto část nezanedbat. Doporučení kontroly vnitřních rozměrů autoklávu může znít jako upozornění na samozřejmost, ale praxe ukazuje, že i zde jsou rezervy. 

Výrobce bioreaktoru vám musí být schopen poskytnout detailní nákres kultivační nádoby s příslušenstvím, které se přenáší do autoklávu. Říkáme tomu "sterilizační rozměry". Je dobré si zkontrolovat část po části, že na nákresu jsou všechny prvky, které plánujete používat na svém fermentoru. Opomenutí Exit Gas Cooleru se může posléze řádně prodražit. I když nebude potřeba kupovat větší autokláv nebo menší kultivační nádobu, tak řešení sklápěcího konektoru pro chladič výstupních plynů je celkem drahá záležitost. 

Vybíráte-li fermentor a autokláv od různých dodavatelů, je lepší předat dodavateli bioreaktoru nákres tlakové nádoby autoklávu, aby vám potvrdil, že nabízená kultivační nádoba se dovnitř vejde. Opačný proces je složitější, protože dodavatel (výrobce) autoklávu nemůže tušit, jaké součástky budou spolu s kultivační nádobou ve sterilizátoru. 

     Obr 1: Jaký rozdíl může být mezi samotnou a plně obsazenou kultivační nádobou

Skutečnost, která se často přehlíží je, že ke sterilizaci nádoby fermentoru potřebujete autokláv vhodný pro kapaliny vybavený také funkcí vakua. Pořídíte-li autokláv bez vakuové funkce, nikdy nebudete schopni zaručit, že proběhla sterilizace 100% povrchu, který je ve styku s produktem.

Vzduch v autoklávu musí být kompletně nahrazen parou. Jedině takto je možné sterilizovat také duté součásti bioreaktoru jako je celá kultivační nádoba, ale především hadičky od peristaltických pumpiček. Pro sterilizaci kultivační nádoby tedy je nutný autokláv s funkcí vakua!

Způsoby sterilizace kultivační nádoby

Stanovený postup sterilizace si musí určit sám uživatel. Běžně se však používají dvě metody:

Sterilizace nádoby s médiem - Fermentační nádoba se naplní kultivačním médiem a provede se sterilizace v autoklávu. Po umístění zpět do bioreaktoru se pouze asepticky doplní sterilní voda. Tato metoda je nejčastěji používaná u fermentací bakterií.

Sterilizace nádoby bez média - Nádobu nelze sterilizovat "na sucho", protože by patrně došlo k poškození sond s elektrolytem. Namísto média se použije trochu vody. Doporučuje se dávkování 10 ml na každý 1 litr pracovního objemu kultivační nádoby, aby bylo zajištěno dostatečné množství páry. Po sterilizaci se do fermentační nádoby napustí sterilní médium aseptickou metodou. Tato metoda se běžně používá při fermentaci tkáňových kultur. 

Příprava před sterilizací fermentoru

Ukázalo se jako velmi užitečné vytvoření seznamu, tzv. "check-listu", který každý uživatel provádějící sterilizaci musí udělat. Níže uvádíme překlad takového seznamu u bioreaktorů INFORS HT:

Kultivační nádoba

• kontrola všech těsnění a O-ringů v portech
• všechny nepoužité porty na víku jsou opatřeny záslepkou
• port pro inokulaci je vybaven membránkou v adaptéru a samotný adaptér uzavřen záslepkou

Sondy

Sterilizace fermentační nádoby bioreaktoru

Zbývá už jenom samotná sterilizace nádoby a příslušenství. V tomto bodě doporučujeme našim zákazníkům i menší nádoby, s celkovým objemem kolem 5 litrů, přenášet do autoklávu ve dvou. Jednak ušetříte za kosmodisk, ale v případě, že jednomu vyklouzne ruka z madla je šance, že druhý "nosič" zastaví nebo alespoň zpomalí pád celku. 

Plně osazená kultivační nádoba (sondy, pumpičky, přípojky,...) o objemu 5 litrů pro fermentor Labfors 5 stojí rádově 300 tisíc korun (+ cena náplně). I kdyby se při pádu rozbilo pouze sklo, je pozdě na otázku, zda-li nebylo lepší celek přenášet ve dvou. 

Samotná fáze sterilizace by měla trvat alespoň 20 - 30 minut při teplotě 121°C. Celková doba, včetně ohřevu a chladnutí, pak zabere přibližně 2 hodiny (při naplnění 1 litrem) až 4 hodiny (při naplnění 3 litry). 

Většina autoklávů má ochranný systém, který nedovolí otevřít víko, dokud je teplota vyšší než 70°C až 80°C. Po vyjmutí z autoklávu nechte kultivační nádobu vychladnout na běžnou pracovní teplotu pod 40°C. Teprve poté zapojte všechny hadice, sondy a další přípojky. 

Pokud zapojíte horkou kultivační nádobu na přípojky vodního okruhu ve snaze urychlit ochlazení kapaliny pomocí fermentoru, může zbytková horká kapalina v hadicích aktivovat ochranný spínač v chladícím okruhu a vyřadit z provozu regulaci teploty!