Kontinuální kultivace jakožto univerzální bioproces pro výrobu

V poslední době se kontinuální kultivace vyvinula z úzce specializované kultivační techniky v populární cestu k lepší automatizaci a kontrole v průmyslových bioprocesech. Ačkoliv jsme zatím pouze v začátcích, je zřejmé, že proces kontinuální kultivace má potenciál stát se “univerzálním bioprocesem”. Kontinuální kultivace je užitečná v případě, že disponujete geneticky stabilní populací mikroorganismů a produktem, který se dlouhodobě projevuje stálou rychlostí a beze změny. Tato metoda umožňuje dosáhnout maximální produktivity na dávku a snižuje celkovou dobu potřebnou pro čištění, sterilizaci a manipulaci s nádobou. V tomto článku představíme možné metodiky, vybavení a kontrolní strategie a odkážeme k hotovým řešením dostupným od INFORS HT

Úvod

Bioprocesy mikrobiálních a buněčných kultur mohou být prováděny několika způsoby v závislosti na technice přidávání a ubírání kapalin. Běžně jsou užívány techniky Batch, fed-batch a perfuze. Kontinuální kultivace je specifická tím, že je během ní po většinu času fermentace médium zároveň přidáváno a odebíráno tak, že jsou počty buněk zachovány v rovnováze.

Zastánci tohoto konceptu (např. Rathore a další, 2016) již delší dobu upozorňují, že aplikace metod kontinuální kultivace na jisté aplikace bioprocesů může mít závažné výhody co do ekonomičnosti, flexibility a automatizace - příkladem může být. produkce biosimiliars v buněčných kulturách savců (Langer & Rader, 2014). Kontinuální kultivace nebyla v minulých dekádách příliš populární mimo několik výzkumných skupin, které se zabývaly metabolickými studiemi, nebo vytvářely studie pro prokázání určité koncepce pro vývoj procesů v malém měřítku. Nápad vytvořit škálovatelný kontinuální proces pro průmyslovou výrobu byl znovu oživen až v poslední době: hlavní hnací silou bylo použití buněčných kultur pro monoklonální antitělesa nebo terapeutická produkce proteinů. Součástí tohoto přehodnocení bylo i opětovné promyšlení přínosu kontinuální kultivace jako obecné techniky produkce, která může zajistit snížení nákladů a umožnit přechod na vysoký stupeň automatizace.

Vývoj přístrojů pro bioprocesy začíná u jednoúčelových balíčků pro kontinuální kultivaci a perfuzi, protože každý nový proces musí být nejprve důkladně otestován v laboratorním měřítku. Nové metodologie, strategie kontroly a integrace následného zpracování tak mohou být vyvinuty před vytvořením jakéhokoliv závazku k výrobě ve větším měřítku. V případě maloobjemových a high-yield procesů může být měřítko poměrně skromné (desítky litrů) protože produktivita kontinuálního procesu je vysoká – v případě monoklonálních antitěles v koncentraci >1 g.L^-1. Nepostradatelný je v tomto případě také software bioprocesů škálovatelný jak pro výzkumná, tak pro výrobní prostředí včetně možnosti přidávat metadata v návaznosti na kontrolu kvality a validaci. Zásadní je také možnost vzdáleného přístupu pro každý typ uživatele.

Postup tímto směrem nemůže být okamžitý a není možné ho provést v jediném kroku. Vývoj procesů v malém měřítku pro akademický a průmyslový výzkum je třeba učinit přístupný použití “soft senzorů”, které umožní nová řešení celkové kontroly bioprocesu, integraci hardwaru třetích stran a také plánování a experimentování v potenciálně velmi rozsáhlém měřítku.

Proč využívat kontinuální kultivaci?

Hodnota kontinuální kultivace jakožto metodologie vychází z jednoduché myšlenky, že individuální vlivy na růst a metabolismus buněk mohou být lépe prozkoumány ve chvíli, kdy pro ně udržujeme neměnné podmínky. V případě výrobního prostředí navíc kontinuální kultivace představuje procesní stav, který je přístupný kontrole a technikám hodnocení, jež jsou obtížně aplikovatelné na procesy s dynamickými fázemi. Na základě těchto dvou komplementárních vlastností můžeme nyní v několika bodech představit přehled aplikací ve vývoji a průmyslu stejně jako výhody plynoucí z užívání metody:

Výzkum:

• Zkoumání v buněčné biologii, kde může sloužit jako zdroj pro velká množství uniformních buněk nebo proteinů
• Obohacení pro specifické části bakteriálních mutantů jako např. auxotrofů, nebo mutantů odolných vůči antibiotikům nebo bakteriofágům pro další vědecký výzkum
• Sběr dat o běžném stavu (steady state) organismu pro vytvoření matematického modelu vztaženého k jeho metabolickým procesům.
• Studium metabolických strategií vyvíjených organismy s odlišnou rychlostí růstu v závislosti na frekvenci ředění
• Analýza metabolických cest v případě hladovění, optimálního nasycení a přesycení látkou, která podmiňuje růst.

Průmysl

• Časté využití při průmyslové výrobě ethanolu
• Vývoj experimentálních modelů kontinuální kultivace v oblasti biotechnologií pro maximalizaci využití vybavení, minimalizaci downtime a zajištění podmínek kultivace, které jsou vhodné pro statistické metody kontroly procesů na základě modelů.

Výhody

• Výměna média: Kontinuální výměna média zaručuje, že jsou buňky stále zásobovány čerstvými živinami. Mimo to je produkt odebírán již od začátku procesu a vedlejší produkty jako toxiny jsou průběžně odstraňovány. Výměna média navíc umožňuje zmírnit účinky změn v metabolismu buněk korelující s ustupující oblastí biologicky aktivního produktu v průběhu procesu - např. Špatné složení během glykosylace.
• Zvýšení délky a rozsahu sklízení: délka fáze růstu/výroby může být prodloužena z několika dní na týdny nebo i měsíce.
• Docílení fyziologicky stálého stavu: Všechny parametry kultury a metabolický status mikroorganismů zůstávají konstantní (μ, V, DO, cX, cS, cP, pH, …).
• Menší bioreaktory mohou být využívány pro stejné množství produktu, což může mít velký dopad na ekonomické využití prostoru, služeb podpory a času obsluhy.
• Účinné využití vybavení downstream processingu: kapacita tohoto vybavení může být rozšířena, když není přetížené žádné z “hrdel lahve” v procesní cestě.
• Perfuze: Pomalu rostoucí buňky jsou udržovány v nádobě, což vede k snižování zdrojů nutných pro produkci semen. Kromě toho je roztok k následnému zpracování zbavený buněk, a tedy snadněji procesovatelný s využitím technik jako kolonová chromatografie, protože může být vynechán krok separace.

Adaptace pro kontinuální kultivaci:

Všechny větší kategorie mikroorganismů a buněk v kapalných kulturách jsou přizpůsobitelné k růstu prostřednictvím kontinuální kultivace. Některé metody mohou vyhovovat lépe než jiné v závislosti na aplikaci, ale pro všechny platí stejná obecná kritéria. Konkrétní adaptace, které se často provádí pro kontinuální kultivaci shrnujeme v tabulce 1.

Řešení Infors HT

Hotová řešení nabízená Infors HT pro kontinuální kultivace činí možným použití “rovnou po rozbalení”. Počínaje přístrojem Minifors 2 jsou bioreaktory Infors HT připraveny pro běžné strategie bioprocesů jako kontinuální kultivace. Minifors 2 nabízí 4 přerozdělovací pumpy, které zpřístupňují vyživování a sklízení na jedno kliknutí. Precizní kontrola frekvence vyživování umožňuje dlouhodobý chod se zajištěním správného dávkování a tím pádem také minimalizaci problémů jako promytí. Se sadami, které zajišťují všechno nutné „potrubí“ jako jsou hadičky a konektory, se neztrácí čas s hledáním správně velkých konektorů.

Tabulka 1. Přehled specifických adaptací, které se často využívají k provádění kontinuální kultivace, a jejich charakteristika.

Periferní vybavení

Všechno potřebné periferní vybavení jako např. lahve a spoje je součástí balíčku. Součástí mohou být také externí vzorkovače z odpadního proudu a aseptický sběr sklizně pro následné zpracování. Infors HT nabízí soubory potřebného hardwaru pro kontinuální kultivace a také prezentace, manuály nastavení a školení, které zajistí správné nastavení a ideální konfiguraci systému.

Pumpy pro sklizeň

Přiřazení integrovaných pump pro příkrm a sklizeň pro použití standardních systémů přímo z krabice. Antifoam pumpa může být nakonfigurována jako pumpa pro sklizeň. Samozřejmostí je také možnost přidání konfigurovatelných nádob s jinými řešeními odstraňování odtoku a využití externích pump. Mimo to je možné použít software eve® pro pokročilou kontrolu příkrmu a kontinuální monitoring toku a stupně nasycení.

Malé nádoby

Malé velikosti nádob umožňují udržení pracovního objemu na nejmenší možné hodnotě. Tento aspekt je obzvláště výhodný v případě početných nebo paralelně probíhajících experimentů pro vývoj a optimalizaci bioprocesů. S fluktuací 1–3 nádob denně pro typickou kontinuální kultivaci vystačí několik stovek mililitrů pracovního objemu ke konzumaci desítek litrů čerstvého média v průběhu 30 až 90 dní. Protože Multifors 2 využívá stejnou technologii jako bioreaktory s většími pracovními objemy, je risk rozdílů při přechodu na větší měřítko minimalizován.

Gravimetrický příkrm

Přesnost rychlosti toku dovnitř i ven může být ještě zvýšena v případě užití gravimetrického příkrmu, který umožňuje naprosto kontinuální práci se stabilním prostředím kultur udržovaným rychlostí přidávání jedné růst-omezující látky. K bioreaktorům INFORS HT mohou být připojeny také externí váhy, které mohou gravimetrický příkrm nastavit lokálně nebo v programu eve pro pokročilé možnosti dávkování ve srovnání s HMI.

Online měření biomasy

Přidání senzorů pro měření biomasy v reálném čase např. za použití turbidity pro zachování maximální hustoty buněk v delších časových úsecích. Senzory turbidity od společnosti Optek s různými optickými celami mohou být přímo napojeny na kontrolní jednotku s hodnotami měření zobrazenými na dotykovém displeji. Koncentrace biomasy může být udržována na konstantní hodnotě uvnitř systému např. prostřednictvím kontroly krmení založené na koncentraci biomasy v softwaru eve®.

Spin filtr

V případě využití zařízení na dělení buněk (jako např. spin filtrů) je možné provádět perfuzi kultury se zachováním buněk v nádobě během odstraňování bezbuněčného supernatantu a nahrazování čerstvým médiem. INFORS HT nabízí otáčivé filtry s velikostí od 10 μm pro Multifors 2 a Labfors 5 pro proces perfuze s pracovním objemem již od 180 ml. Tímto způsobem mohou být získána zásadní procesní data s nízkou spotřebou média ještě před rozšířením produkce. Spin filtry se často využívají v kombinaci s mikronosiči. pro zadržení buněk mohou být kromě spin filtrů využita i externí zařízení jako např. ATF filtr.

Soft senzory vztahující se ke kontinuální kultivaci

Soft senzory mohou poskytnout hodnotný vhled do průběhu bioprocesu kontinuální kultivace a pomoci vylepšit strategie krmení, vypočítat rychlost ředění a monitorovat naplněnost lahví. Flexibilní skriptovací prostředí umožňuje generování a využívání strategií pro kontrolu a interpretaci dat, které jsou vysoce modifikovatelné, přizpůsobitelné aplikaci nebo dokonce založené na specifickém modelu.

Shrnutí

Řešení nabízená společností INFORS HT umožňují využití výhod kontinuální kultivace ve výzkumu malého rozsahu a v laboratořích pro vývoj procesů v podobě několika předem hotových řešení. Mimo samotnou kontinuální kultivaci přístroj obstarává také separaci buněk přímo v nádobě a odtok využívající techniky perfuze. Přidáním sofistikovaných strategií kontroly procesu jako např. gravimetrického dávkování prostřednictvím eve softwaru vzniká kompletní balíček služeb.

Kontinuální kultivace byla po dekády využívána v rámci specializovaných aplikací, ať už pro studie zabývající se metabolismem, nebo pro optimalizaci zdrojů u produktů nízké hodnoty. Příchod farmaceutických aplikací zaměřujících se na produkci hodnotných a maloobjemových biologicky aktivních proteinů, jako např. monoklonálních antitělísek dal kontinuálním kulturám možnost zaujmout novou roli. Produkce biosimiliars v buňkách savců je v současnosti velmi důležitá aplikace, jejímž prvním úkolem je prozkoumání možností snížení nákladů a optimalizace procesu - balíčky INFORS HT pro tento krok představují ideální nástroj.